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点点滴滴
在传统检测领域，科赫法则属于“金标准”，在现行检验策略上仍然有举足轻重的地位。在科赫法则中，要求使用培养分离的方式鉴定病原体。但是培养法存在一个缺陷，是无法准确区分属以下分级（即种和亚种）的病原体。而不同种，甚至不同亚型（或血清型）造成的病症并不完全一样，治疗措施也可能大相径庭。此外，还因其他微生物污染的客观存在，单一的培养法检测病原体会造成大量误判，通常需要辅以其他技术手段佐证。这种现象被称为交叉，即“假阳性”。
交叉现象理论上存在于任何一种检测方法学中，操作中可以通过优化检测手段来降低交叉现象的发生率，但是很难做到完全消除。
为何会出现交叉现象？
基于分子探针法的荧光PCR技术是依赖于目标生物核酸序列开发的分子检测技术，该技术在可以很好地解决传统培养法中无法区别至种的问题，还可以有效区分亚型或血清型。
但是，亲缘关系越近的物种，其核酸序列相似程度越高，这样会给以检测核酸序列的探针法荧光PCR技术带来交叉的困扰。例如细菌的16S rDNA是鉴别细菌常用的核酸序列，序列特点是种内高度保守，种间相对特异。从中选取一条检测大肠杆菌16S rDNA的分子探针序列，然后使用此序列在NCBI中进行序列比对，比对结果如下图所示：
图1 探针核苷酸序列比对结果
从图中看，该条序列不仅可以检测大肠杆菌，还可以检测到沙门氏菌、多杀性巴斯德菌、霍氏肠杆菌、阪崎肠杆菌等非大肠杆菌的细菌。
怎么解决交叉问题？
基于分子探针法的荧光PCR技术主要依赖特异性引物和分子探针提供特异性，如果想解决交叉问题主要从以下几方面入手：
1.选取物种特异性基因：根据需要检测的生物特征，选取该生物特有的基因。例如鼠疫杆菌控制荚膜合成的基因为该菌所特有，在此基因上设计检测引物和探针，可以很大程度上避免交叉现象的出现。
2.选用多种探针设计形式：对于限制了检测基因区域，若区域成高度保守，可以选用MGB的探针形式，这种分子探针序列较短，理论上可以区分1个碱基的差异。
3.优化反应条件：高退火温度会降低PCR效率，但是能减少非特异性的扩增。适度的提高退火温度可以降低交叉现象的发生。
4.选取具有高保真的DNA聚合酶：高保真的DNA聚合酶纠错能力较一般的DNA聚合酶强，可以使PCR过程中错配现象大大降低。
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