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点点滴滴
本期迎来《荧光PCR技术常见困扰专题》的终结篇，我们将聚焦大家都关心的脱靶问题展开讨论。还想查看前期系列文章？免爬楼合集如下！
系列专题
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作为生物遗传物质的核酸为了更快的适应生存环境，会不断的以突变、重组、整合等方式丰富自身基因丰度。研究发现，除了一些需要高度保守的基因区域（例如管家基因）外，其他基因区域都存在或多或少的突变现象。除此之外，一些生物的由于其遗传物质的特殊性，基因突变异常迅速，比如引发全球疫情的新型冠状病毒，从2019年末开始至2022年底，共3年多的时间内，已经有了几百个突变株。过快的突变速度，也使相当一部分的新冠核酸检测试剂迅速失效。究其原因便是检测区域核酸发生突变后造成的检测脱靶。
什么是脱靶？
WHAT IS OFF-TARGET
顾名思义，脱靶意味着假阴性的出现。对于基于探针法的荧光PCR而言，理论上部分碱基的不匹配，可能会造成检测效率大幅降低，而在FRET探针法和MGB探针中会造成脱靶现象，这种特性也是探针法荧光PCR技术维持高特异性的基础之一。但也正由于这种特性，大大增加了引物探针序列的设计难度。下图对4条人类Alu基因进行了序列比对（4条序列均来自于GeneBank），从图中可以看出，在短短40个碱基长度内（175-215），出现了基因点突变和缺失/插入两种突变类型共6个位点的突变。若要想在此段区域内设计一条普通探针检测序列，难度相当大。
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也许会有小伙伴提出可以多设计几条探针，或者改变探针形式，再或者直接更换检测方法。上述的想法理论上可行，但是不具备可操作性。例如4条不同的序列可以设计4条探针，但是这样的话不仅实验成本会翻4倍，探针序列越多，对PCR体系造成的影响越大。此外，即便是4条探针也无法覆盖所有人的Alu序列。其次，无论探针形式如何变化（taqman、MGB、分子信标等等）都无法兼顾低成本和低脱靶率。
如何解决脱靶？
HOW TO RESOLVE
理论上讲，任何一种检测方法都存在脱靶的概率。因此，我们只能尽可能的降低脱靶率，在成本和脱靶率之间做到收益最大化才是设计引物探针的前提。在此前提下，研发人员应该仔细考量每条序列的来源，若某条序列在非理论应用场景下才出现，则可以放弃检测该条序列。其次，在比对序列时尽可能选择多条来源的核酸序列，这样可以使比对的范围扩大，更明确的区分出保守区和非保守区。
关于我们
微谱于2014年正式涉足生物制品服务领域，2019年成立微谱生物科技有限公司，成为集团在生物药领域的重要战略布局。2022年公司荣获“江苏省民营科技企业”称号。
微谱生物科技立足于生物医药全产业链，依托创新型自主知识产权体系构建出成熟的生物制品质量研究平台、生物安全服务平台、GMP验证及法规咨询服务平台、药包材研究服务平台以及药械知识产权服务平台，致力于为国内外生物药企业提供合规、专业、一体化的生物制品质量与安全研究综合解决方案。
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